Evaluación de Streptomyces lividans como hospedero para la expresión de interferón alfa 2b y estreptoquinasa

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Pimienta Rodríguez, Elsa Teresita

Resumen	Los hospederos heterólogos se utilizan frecuentemente para la producción de proteínas de interés biofarmacéutico como una alternativa eficaz al aislamiento a partir de su fuente natural. Escherichia coli ha sido el hospedero heterólogo más utilizado. Sin embargo, muchas proteínas se acumulan en cuerpos de inclusión, lo cual dificulta los procesos de replegamiento de estas en su conformación nativa. En contraste, las bacterias grampositivas como Streptomyces lividans ofrecen la ventaja de secretar las proteínas al medio de cultivo y esto favorece su correcto plegamiento y facilita su purificación. En este trabajo se evalúa la utilidad de S. lividans TK24 para secretar interferón a 2b humano (IFNa2b) y estreptoquinasa de Streptococcus equisimilis ATCC9542 (SKC-2) biológicamente activos al medio de cultivo. Para mediar la secreción de ambas proteínas se seleccionaron los péptidos señales del inhibidor de subtilisina de Streptomyces venezuelae CBS762.70 (Vsi-sp) –dependiente de la vía Sec-, de la xilanasa C de Streptomyces lividans –dependiente de la vía Tat- y el de la lipasa A de Streptomyces exfoliatus M11 (LipA-sp), el cual no había sido utilizado con anterioridad. S. lividans TK24 secretó la SKC-2, fusionada al Vsi-sp, biológicamente activa al medio de cultivo hasta 4 mg l-1. La SKC-2 fue purificada a escala de laboratorio mediante las cromatografías de intercambio iónico e interacciones hidrofóbicas; lo que permitió aumentar su pureza hasta el 90%. La SKC-2 purificada tuvo una actividad específica de 35 928 UI mg–1 y su identidad fue verificada mediante la secuenciación de su extremo amino. Además, la proteína purificada tuvo un máximo de absorción UV característico a los 277 nm. Los niveles de la SKC-2 secretada aumentaron hasta 15 mg l-1 cuando la cepa recombinante fue cultivada siguiendo un procedimiento de fermentación por lote no optimizado a escala de banco. Este incremento en la cantidad secretada de la SKC-2 muestra el potencial que tiene la optimización de la fermentación de S. lividans para la obtención soluble de la estreptoquinasa SKC-2. El IFNa2b fue secretado biológicamente activo al medio extracelular de S. lividans TK24 cuando se fusionó al Vsi-sp o al LipA-sp a niveles
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Resumen

Los hospederos heterólogos se utilizan frecuentemente para la producción de proteínas de interés biofarmacéutico como una alternativa eficaz al aislamiento a partir de su fuente natural. Escherichia coli ha sido el hospedero heterólogo más utilizado. Sin embargo, muchas proteínas se acumulan en cuerpos de inclusión, lo cual dificulta los procesos de replegamiento de estas en su conformación nativa. En contraste, las bacterias grampositivas como Streptomyces lividans ofrecen la ventaja de secretar las proteínas al medio de cultivo y esto favorece su correcto plegamiento y facilita su purificación. En este trabajo se evalúa la utilidad de S. lividans TK24 para secretar interferón a 2b humano (IFNa2b) y estreptoquinasa de Streptococcus equisimilis ATCC9542 (SKC-2) biológicamente activos al medio de cultivo. Para mediar la secreción de ambas proteínas se seleccionaron los péptidos señales del inhibidor de subtilisina de Streptomyces venezuelae CBS762.70 (Vsi-sp) –dependiente de la vía Sec-, de la xilanasa C de Streptomyces lividans –dependiente de la vía Tat- y el de la lipasa A de Streptomyces exfoliatus M11 (LipA-sp), el cual no había sido utilizado con anterioridad. S. lividans TK24 secretó la SKC-2, fusionada al Vsi-sp, biológicamente activa al medio de cultivo hasta 4 mg l-1. La SKC-2 fue purificada a escala de laboratorio mediante las cromatografías de intercambio iónico e interacciones hidrofóbicas; lo que permitió aumentar su pureza hasta el 90%. La SKC-2 purificada tuvo una actividad específica de 35 928 UI mg–1 y su identidad fue verificada mediante la secuenciación de su extremo amino. Además, la proteína purificada tuvo un máximo de absorción UV característico a los 277 nm. Los niveles de la SKC-2 secretada aumentaron hasta 15 mg l-1 cuando la cepa recombinante fue cultivada siguiendo un procedimiento de fermentación por lote no optimizado a escala de banco. Este incremento en la cantidad secretada de la SKC-2 muestra el potencial que tiene la optimización de la fermentación de S. lividans para la obtención soluble de la estreptoquinasa SKC-2. El IFNa2b fue secretado biológicamente activo al medio extracelular de S. lividans TK24 cuando se fusionó al Vsi-sp o al LipA-sp a niveles

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Institución donde se realiza	Universidad de Ciencias Médicas de La Habana

Tipo de tesis	Doctor en Ciencias Doctor en Ciencias de una Especialidad
Provincia	La Habana
Año de defensa de la tesis	2009

Tutor 1	Vallín Plous, Carlos
Tutor 2	Anné, Jozef

Versión de tesis	No publicado

Materia	Compuestos Químicos y Drogas -- Aminoácidos, Péptidos y Proteínas -- Interferones Organismos -- Bacterias -- Bacterias Grampositivas Técnicas Analíticas, Diagnósticas y Terapéuticas y Equipos -- Técnicas y Procedimientos de Laboratorio
Lista de descriptores	Cuba Interferón alfa-2b Streptomyces lividans Estreptoquinasa/aislamiento & purificación
Número de la resolución	10/2009
Año resolución	2009
Texto Completo	Público

Modificado el	2023-07-20 09:42:18
Fecha creación	2023-06-28 06:12:24
Fecha de publicación	2023-06-28 06:12:24

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